Μεταλλάξεις, πολυμορφισμοί, σημειακές μεταλλάξεις, νοθευμένα, αλλεργιογόνα τρόφιμα, φάρμακα, PCR, HRM, Real Time PCR, Multiplex, Allele-Specific, ψηφιακή PCR, RFLP
XBA 53
7
161
ΠΕΡΙΛΗΨΗ
Η ανακάλυψη όλο και περισσότερων γνωστών/αγνώστων μεταλλάξεων/πολυμορφισμών, παθογόνων μικροοργανισμών ( ηπατίτιδας Β και C, HIV-1, κ.α.), η ανάγκη για διάγνωση γενετικών ασθενειών (θαλασσαιμίες, κυστική ίνωση, μυϊκή δυστροφία κ.α), η σωστή και έγκαιρη κλινική διάγνωση ασθενειών, η κατάλληλη φαρμακευτική αγωγή, η ασφάλεια ποιότητας τροφίμων, ο κίνδυνος αλλοιωμένων, νοθευμένων, αλλεργιογόνων τρόφιμων στον πληθυσμό απαιτούν τεχνικές ανάλυσης γρήγορες και με ευαισθησία. Αντίστοιχα, η ανίχνευση δακτυλικών αποτυπωμάτων DNA, η ανάλυση σύνθετου μείγματος σωματικών υγρών, οι βιασμοί, οι δολοφονίες, η διαλεύκανση υποθέσεων στην ιατροδικαστική και στη εγκληματολογία απαιτούν κατάλληλες τεχνικές. Ο κατάλληλος μοριακός προσδιορισμός για πρόγνωση, προσαρμογή-παρακολούθηση μιας θεραπείας και αξιολόγηση για πιθανή ύφεση/υποτροπή μιας ασθένειας, επιλογή καταλληλότερου φαρμάκου, είναι απαραίτητος για τον σύγχρονο άνθρωπο
Στο κεφάλαιο ένα γίνεται αναφορά στην PCR. Μια in vitro τεχνική πολ/σμού (έως και 109 φορές) αλληλουχίας DNA, μια διαδικασία τριών βημάτων (35-40 κύκλοι). Αναπτύχθηκε από τον βιοχημικό Kary Mullis (1983-1985), εξελίχθηκε, διαφοροποιήθηκε ανάλογα με τις ανάγκες από πολλούς επιστήμονες έως και σήμερα. Στο κεφάλαιο αναφέρονται οι μεταλλάξεις /πολυμορφισμοί, δίνονται ορισμοί, προέλευση, η δομή του DNA κ,α. Το κεφάλαιο τρία ορίζει προδιαγραφές (ευαισθησία, καταλληλότητα μεθόδου, κόστος, προδιαγραφές ανάλυσης) και σημεία ελέγχου για την εφαρμογή μοριακών μεθόδων ανίχνευσης τους. Αναλύονται οι μέθοδοι, η βασική αρχή λειτουργίας τους, αξιολόγηση παραμέτρων, πλεονεκτήματα, μειονεκτήματα και μέθοδοι εντοπισμού μιας μετάλλαξης. Το κεφάλαιο τέσσερα επισημαίνει τα σημεία επιλογής της καταλληλότερης μεθόδου PCR αναφορικά με το ποσοστό εκλεκτικότητας, εμπλουτισμού γνωστών μεταλλάξεων. Ενώ στο κεφάλαιο πέντε αναδεικνύονται τα συμπεράσματα που προκύπτουν από αυτή τη μελέτη, ξεκινώντας από τη μέθοδο με τα περισσότερα πλεονεκτήματα.
Στόχος της εργασίας είναι να μελετηθούν μεθοδολογίες PCR, όπως HRM, Real Time, Multiplex, Allele-Specific κ.α. για ανίχνευση σημειακών μεταλλάξεων πολυμορφισμών. Η μελέτη ανέδειξε ένα σύνολο μεθόδων με πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα για κάθε μια. Αξιολογήθηκαν σύμφωνα με το βαθμό ευαισθησίας τους ευελιξίας, κόστους, κ.α.
Λέξεις - Κλειδιά:
Μεταλλάξεις, πολυμορφισμοί, σημειακές μεταλλάξεις, νοθευμένα, αλλεργιογόνα τρόφιμα, φάρμακα, PCR, HRM, Real Time PCR, Multiplex, Allele-Specific, ψηφιακή PCR, RFLP
Abstract
The discovery of more and more known/unknown mutations/polymorphisms, pathogenic microorganisms (hepatitis B and C, HIV-1, etc.), the need to diagnose genetic diseases (thalassemias, cystic fibrosis, muscular dystrophy, etc.), the correct and on time clinical diagnosis of diseases, appropriate medication, food quality safety, the risk of spoiled, adulterated, allergenic foods in the population, require fast and sensitive analysis techniques. Accordingly, DNA fingerprinting, complex body fluid analysis, rape, murder, forensics and criminology cases require appropriate techniques. Appropriate molecular determination for prognosis, adjustment-monitoring of a treatment and evaluation for possible remission/relapse of a disease, selection of more appropriate drugs, is essential for modern man
In chapter one reference is made to PCR. An in vitro amplification (up to 109-fold) DNA sequencing technique, a three-step process (35-40 cycles). It was developed by the biochemist Kary Mullis (1983-1985), it has been developed and differentiated according to the needs of many scientists until today. The chapter mentions mutations / polymorphisms, gives definitions, origin, the structure of DNA, etc.
Chapter three defines specifications (sensitivity, method suitability, cost, analysis specifications) and control points for the application of molecular methods of their detection. The methods are analyzed, their basic operating principle, parameter evaluation, advantages, disadvantages and methods of detecting a mutation.
Chapter four highlights the selection points of the most appropriate PCR method in terms of selectivity rate, enrichment of known mutations. While chapter five highlights the conclusions, drawn from this study, starting with the method with the most advantages.
The aim of this study is to evaluate PCR methodologies, such as HRM, Real Time, Multiplex, Allele-Specific etc. for detection of point mutation polymorphisms. The study highlighted a number of methods with advantages and disadvantages for each and every one of them. They were evaluated according to their degree of sensitivity, flexibility, cost, etc.
Keywords:
Mutations, polymorphisms, point mutations, adulterated allergenic food, drugs, PCR, HRM, Real Time PCR, Multiplex, Allele-Specific, digital PCR, RFLP.
