Οι θειικοί μεταβολίτες της τεραϋδρο-μεθυλοτεστοστερόνης έχουν καθιερωθεί ως μακροπρόθεσμοι βιοδείκτες της χρήσης μεθυλοτεστοστερόνης για σκοπούς ντόπινγκ και μπορούν να ανιχνευθούν σε άθικτη μορφή με LC-MS/(MS). Ωστόσο, η ταυτοποίησή τους σύμφωνα με τις προδιαγραφές του τεχνικού εγγράφου του Παγκόσμιου Οργανισμού Αντι-Ντόπινγκ, WADA TD2023IDCR, παραμένει μια αναλυτική πρόκληση, λόγω του ανεπαρκούς φάσματος ιόντων υπό συνθήκες διάσπασης που προκαλείται από σύγκρουση (CID) σε λειτουργία αρνητικού ιονισμού. Στην παρούσα μελέτη, έξι από τους οκτώ πιθανούς θειικούς μεταβολίτες της τετραϋδρο-μεθυλοτεστοστερόνης συντέθηκαν σε μικροκλίμακα προκειμένου να διευκολυνθεί τόσο η δομική τους αποσαφήνιση, όσο και η ανάπτυξη μεθόδων άμεσης ταυτοποίησης. Η ταυτοποίησή τους βασίστηκε στην ανάλυσή τους με GC-MS/(MS) μετά από παραγωγοποίηση με TMS ή στην ανάλυση με LC-HRMS/(MS) μετά από παραγωγοποίηση της ελεύθερης 17β-υδροξυλομάδας με καρβονυλοδιιμιδαζόλη (CDI), οδηγώντας σε παράγωγα 17β-OH-ιμιδαζολικών καρβαμιδικών ενώσεων. Τα παράγωγα που προέκυψαν, μπορούσαν να ανιχνευθούν ως είδη M-H σε λειτουργία αρνητικού ιονισμού και ως είδη [M−H2SO3−CDI+H] σε λειτουργία θετικού ιονισμού. Το φάσμα ιόντων που προέκυψε σε αρνητική λειτουργία έδειξε δύο χαρακτηριστικά ιόντα: ένα εξαιρετικά πλούσιο σε πληροφορίες που προέκυψε από την απομάκρυνση της ομάδας παραγωγοποίησης, μετά τον σχηματισμό της αφυδατωμένης δομής στεροειδούς, διατηρώντας τη θειική σύζευξη και ένα δεύτερο ιόν που προέρχεται από το θειικό τμήμα του μορίου. Στη λειτουργία θετικού ιονισμού, τα φάσματα ήταν εξίσου χρήσιμα και χαρακτηριστικά των στεροειδών. Δείγματα ούρων από δυο μεταβολικές μελέτες απέκκρισης της 17α-μεθυλοτεστοστερόνης αναλύθηκαν με τις παραπάνω μεθόδους. Τα παράθυρα ανίχνευσης και ταυτοποίησης των ακέραιων θειικών μεταβολιτών εκτιμήθηκαν βάσει του τεχνικού εγγράφου TD2023IDCR και συγκρίθηκαν με αυτά που προέκυψαν από την ανάλυση με GC-MS/(MS) του γλυκουρονιδικού κλάσματος, έπειτα από ενζυμική υδρόλυση. Συνολικά, η συνεισφορά των θειικών μεταβολιτών της τετραϋδρο-μεθυλοτεστοστερόνης επεκτείνει σημαντικά το παράθυρο του χρόνου ανίχνευσης για την κατάχρηση της μεθυλοτεστοστερόνης. Παρόλα αυτά, το καθορισμένο παράθυρο χρόνου
ταυτοποίησης ήταν παρόμοιο ή μικρότερο από εκείνο που προέκυψε από την ανάλυση του γλυκουρονιδικού κλάσματος.
Tetrahydro sulfate metabolites are established long-term biomarkers of methyltestosterone use and can be detected intact by LC-MS/MS. However, their identification under the provisions of the WADA TD2023IDCR remains an analytical challenge, due to their poor product ion spectra under collision-induced dissociation conditions in negative ion mode. In this study, six out of eight potential tetrahydro-methyltestosterone sulfate metabolites were microscale-synthesized and used for method development for their identification, based on GC-MS/(MS) after TMS derivatization or LC-HRMS/MS after derivatization of the free 17β-hydroxy group with carbonyldiimidazole (CDI), producing 17β-OH-imidazole carbamate derivatives. Imidazole carbamate derivatives were detected as M-H species in negative ion mode and as [M-H2SO3-CDI+H] species in positive ion mode. Negative mode product ion spectra showed two product ions; one highly informative resulting from the elimination of the derivatization group, following the formation of the dehydrated steroid moiety, which preserves the sulfate conjugation, and a second ion derived from the sulfate moiety. Ιn positive mode, spectra were highly informative and characteristic of steroids. Urine samples from two 17α-methyltestosterone excretion studies were analyzed using these methods, and detection/identification windows of intact sulfate metabolites were estimated under TD2023IDCR and compared with those obtained from GC-MS/(MS) analysis of the glucuronide fraction after hydrolysis. Overall, the inclusion of the tetrahydro-methyltestosterone sulfate metabolites significantly extends the detection time window for methyltestosterone abuse. Still, the established identification time window was similar to, or shorter than, that derived from the glucuronide fraction analysis.
