Ο μεταγραφικός παράγοντας ZBTB7A (LRF) αποτελεί γνωστό καταστολέα της έκφρασης των γονιδίων της γ-αλυσίδας της αιμοσφαιρίνης, για τη αποσιώπηση της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης (HbF) στους ενήλικες. Η επανενεργοποίηση της HbF μέσω της καταστολής της έκφρασης του ZBTB7A θα μπορούσε, επομένως, να αποτελέσει μια καινοτόμο στρατηγική για τη θεραπεία των β-αιμοσφαιρινοπαθειών. Με βάση την προοπτική αυτή, σχεδιάστηκαν επισωματικά εργαλεία CRISPR, με στόχο την επίτευξη της στοχευμένης επιγενετικής καταστολής του γονιδίου ZBTB7A σε κύτταρα K562, χωρίς την εισαγωγή μόνιμων γονιδιωματικών αλλοιώσεων. Η καταλυτικά αδρανής πρωτεΐνη Cas9 (dCas9), συντήχθηκε είτε με την DNA μεθυλοτρανσφεράση 3A (DNMT3A) για στοχευμένη μεθυλίωση του DNA, είτε με την αποακετυλάση ιστονών 1 (HDAC1) για αποακετυλίωση των ιστονών και οι αλληλουχίες σύντηξης ενσωματώθηκαν στον επισωματικό φορέα pEPI-1, μαζί με δύο ειδικούς RNA οδηγούς (sgRNAs) που στοχεύουν τη νησίδα CpG 326 ανοδικά του ZBTB7A, επιτρέποντας στα επιγενετικά ένζυμα να τροποποιήσουν ταυτόχρονα το επιγενετικό τοπίο. Η ανθρώπινη ερυθρολευχαιμική κυτταρική σειρά K562 συν-διαμολύνθηκε με τους δύο φορείς. Ο σκελετός του pEPI-1 περιλαμβάνει την αλληλουχία S/MAR (Scaffold/Matrix Attachment Region) η οποία εξασφαλίζει τη σταθερή διατήρηση των επισωμάτων στον πυρήνα των διαιρούμενων κυττάρων και τη σταθερή έκφραση των διαγονιδίων. Οι διπλά θετικοί διαμολυσμένοι κλώνοι K562 καλλιεργήθηκαν για 80 ημέρες και αναλύθηκαν σε τρία χρονικά σημεία. Η digital PCR επιβεβαίωσε τη σταθερή διατήρηση των επισωμάτων σε 1,5-2 αντίγραφα ανά κύτταρο καθ’ όλη τη διάρκεια της καλλιέργειας. Η ποσοτική PCR (qPCR) αποκάλυψε μείωση της έκφρασης του ZBTB7Aκατά 3,3 φορές έως το τρίτο χρονικό σημείο, συνοδευόμενη από μικρή, αλλά σταθερή αύξηση της μεθυλίωσης εντός της νησίδας CpG 326, πλησίον της θέσης στόχευσης ενός sgRNA, όπως αξιολογήθηκε με πυροαλληλούχηση. Η μείωση της έκφρασης του ZBTB7A οδήγησε σε αύξηση κατά δύο φορές της έκφρασης των γονιδίων HBG1/2 και αύξηση της παραγωγής αιμοσφαιρίνης, γεγονός που επιβεβαιώθηκε με digital PCR και χρώση βενζιδίνης, αντίστοιχα. Η μελέτη αυτή αποτελεί την πρώτη επιτυχημένη εφαρμογή επισωματικών φορέων S/MAR για τη μεταφορά εργαλείων CRISPR-επιγενετικής επεξεργασίας με στόχο την επαγωγή της HbF και δίνει τις βάσεις για την ανάπτυξη γονιδιακών θεραπειών επόμενης γενιάς για τις β-αιμοσφαιρινοπάθειες.

The transcription factor ZBTB7A (LRF) is a known repressor of γ-globin gene expression, cooperating with chromatin remodelers to silence fetal hemoglobin (HbF) in adults. Reactivation of HbF through modulation of the γ-globin genes’ repressor LRF could therefore represent an innovative strategy for β-hemoglobinopathy treatment. We designed episomal CRISPR systems to achieve sequence-specific epigenetic repression of the ZBTB7A gene in K562 cells and allow for gene regulation without introducing permanent genomic alterations. The catalytically inactive Cas9 protein, dCas9, fused with either DNA methyltransferase 3A (DNMT3A), for targeted DNA methylation, or histone deacetylase 1 (HDAC1), for histone deacetylation, was incorporated within the pEPI-1 episomal vector, along with specific single guide (sg)RNAs targeting the CpG island 326 upstream of ZBTB7A, allowing the epigenetic enzymes to simultaneously modulate the epigenetic landscape. The human erythroleukemia cell line K562 was co-transfected with both CRISPR-constructs. The pEPI-1 backbone includes the Scaffold/Matrix Attachment Region (S/MAR), to ensure mitotically stable, non-integrative maintenance and stable expression of the constructs. K562 transfected double-positive clones were continuously cultivated for 80 days and analyzed at three time-points. Digital PCR confirmed stable episome retention at 1,5-2 copies per cell throughout the duration of cell culture. qPCR revealed a 3,3-fold reduction in ZBTB7A expression, by the third time-point, accompanied by a moderate, but stable increase in methylation within the targeted CpG island, near the sgRNA targeting site, assessed by pyrosequencing CpG assay. Downregulation of ZBTB7A led to a 2-fold increase in HBG1/2 expression and enhanced HbF hemoglobin synthesis, verified by digital PCR and benzidine staining, respectively. This study demonstrates a locus-specific epigenetic intervention in ZBTB7A expression, using a stable, episomal CRISPR/dCas9 platform, and enables precise gene modulation without genomic integration, highlighting its potential as a therapeutic tool in β-hemoglobinopathies.